导读
目前的数据表明，临床中只有不到一半的脑炎病例能确定病因，人们认识到需要通过严格的取样和改进诊断技术相结合来解决这个问题。NGS（高通量测序）正是一种有力的方法，可以对临床样本中的病原体进行全面和准确的检测。本文通过查阅25篇文章、44例脑炎患者病例报道回顾了这项新技术在疑似传染性脑炎中的应用，并讨论了引入NGS作为一线诊断实验的可行性。
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文献ID
题目：Encephalitisdiagnosisusingmetagenomics:applicationofnextgenerationsequencingforundiagnosedcases
译文：运用宏基因组诊断脑炎：高通量测序在未确诊病例中的应用
期刊：JournalofInfectionIF：5.
发表时间：-01-02
通讯作者：DrJulianneRBrown
通讯单位：GreatOrmondStreetHospital
当前脑炎管理中的问题
1
脑炎的定义为与神经功能障碍相关的脑组织炎症，目前全球约有50万病例，这项综合征包含无数不同的疾病，具有不同的全球分布和临床特征。感染是最常见的病因，占20%～50%。已知有上百种病原体与脑炎有关。
2
即使在设备最好的医疗中心，也有三分之一的脑炎病例未被确诊，目前的诊断与治疗被公认为存在挑战与不足。脑炎总体的死亡率约30%，并且高度可变，这取决于病因学和获得支持性治疗的机会。
3
在过去的十年里，人们引入了急性脑炎综合征管理指南，但是各种指南之间存在差异，例如诊断的评估方法，这些差异反应了地域的病因、发表的时间、技术的发展和可利用的资源的不同。总体来说目前仍然缺乏诊断病原的系统性方法。
脑炎的诊断学与现代技术的作用
目前对疑似感染病例的诊断依赖于人们对病原体先前认知，根据临床表现、流行病学数据、指南和当地资源对疾病进行相应的诊断，很大程度上依赖于PCR技术和血清学检测，由于导致脑炎的病原体种类繁多，且难以检测新的和意想不到的病原体，因此这种方法的局限性很大。利用镜检与培养的方法来发现新的病原体虽然已经存在很多年，但是这些方法比较繁琐、耗时、且缺乏敏感性与特异性。
NGS介绍及在脑炎诊断中的潜在应用
NGS也被称为深度测序，从每个DNA片段中生成一条单独的序列或cDNA，下游分析可以区分不同标本来源的序列片段，如人类、细菌、病*等。这就意味着宿主与微生物混合的样本也可以被检测（图1）。NGS可以检测出样本中所有微生物的遗传物质，然后与数据中的已知序列比对从而得知未知序列的来源（图2），相比较PCR等靶向诊断方法，NGS不需要提前预判和假设病原体，因此可以检测出新发和未知病原体。
图1PCR与宏基因组检测病原体技术的比较
图2宏基因组检测病原体的流程
查阅结果
搜索了25篇文章（图3），包含44例病例报道。在过去十年中，病例呈指数增长（图4）。病例的发源地包括多个国家，在有年龄记录的27例报道中，中位年龄为14岁；在有提到患者免疫力的22例报道中，有16例患者免疫功能低下。
图3文献查阅流程
图4过去十年中有关NGS诊断脑炎的发表趋势
讨论
1
在44例报道中，有16例病因可用PCR等靶向检测方法确认；这些病原体为一些常见的微生物，但在其余的28例中，有18例新的、5例罕见的、5例意想不到的病原体，这些微生物不太可能通过PCR等靶向检测方法确认。
2
对于临床意义尚不清楚的病原体，证明因果关系尤为重要，有33/44例患者通过PCR的方法证实了病原体的存在，但是无助于证明因果关系。
诊断率
1
因为关于利用宏基因组诊断脑炎病例的报告都是由单个病例报告组成，所以评估其阳性率比较困难。
2
其中5个报道中涉及检测多个脑炎病例，诊断率分别为0%、1.6%、6%、19%、和30%。这些研究只包括使用常规方法检测为阴性的样本，因此无法评估NGS作为一线诊断的阳性率，据报道，NGS作为一线诊断的阳性率会更高。
3
脑脊液中的病原体载量往往比脑活检中要低，因此脑活检的阳性率应该会比脑脊液要高。在其中三个病例中，脑脊液中未检测到病原体，但脑活检中检测到病原体，没有出现过相反的情况。
NGS用于常规诊断的可能性
质量保证：
1
需要广泛验证其特异性与灵敏度，以保证检测结果稳定、准确和可重复性。
2
每次测序都需要加入阳性对照与阴性对照，保证检测结果的准确性。
时效性：
只有5例报告讲述了样本采集到病原体检测的时间，为2-6天。PCR检测手段一般为4-12小时，NGS在检测速度上还有待提高，随着文库制备和测序速度的提升，检测周期会在未来几年得到显著的改善。
NGS病原微生物检测的局限性
1
这项技术的广泛性使得它无法确定每一种可能的生物体的灵敏度或检测限（LOD）。
2
在宏基因组中，不同样本类型在基因组质量上、宿主和病原体序列的比例以及标本复用度上都存在差异，但我们可以通过严格控制实验和测序流程来克服其中一些局限性。
3
测序出来的序列只有与所选数据库中存在的生物具有同源性才能被识别，如果数据库中没有该生物的序列，将无法被识别，所以阴性结果降低了感染结果的可能性，但不能排除感染。
4
样本中宿主序列的比率可能高于99%，这样比较浪费成本及影响检测时间；因此，提升去除样本中宿主DNA/RNA比例的技术有助于降低成本和时间，并提高检测的敏感性。
NGS在脑炎诊断的应用建议
1
NGS在识别未诊断的病原体方面具有惊人的潜力，并且还可以用于其他临床症状的检测，如呼吸道感染。因此，在临床实验室中实施这项技术将对脑炎以外的感染诊断具有更广泛的意义。
2
建议将NGS常规应用于PCR靶向技术未检测出病因的急性脑膜炎病例的诊断。
3
由于当地流行病学的不同，临床医生应参考相关的国家指南，然而，在免疫低下的患者中，应该更早地考虑NGS，图5总结了NGS应用于脑炎诊断中的建议。
图5NGS应用于脑炎诊断中的建议
公司介绍
上海锐翌生物科技有限公司成立于年10月，是一家专业从事基因科技及健康服务的国家高新技术企业。锐翌生物依托高通量测序技术平台，专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破，以及在医学上的转化应用。助力高等院校、医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题，助力更多优质科研成果发表。同时，在大肠癌早期筛查、临床病原宏基因组检测和健康管理等精准医疗领域开发检测技术及应用方案，致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务，目前已和全国医院达成深度合作。
公司于年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号，目前已在杭州、青岛等地成立区域中心，其中青岛医学检验所于年9月投入使用。
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