年3月，DanielWüthrich，TorstenSeuberlich等人在《Virology》发表文章：Exploringtheviromeofcattlewithnon-suppurativeencephalitisofunknownetiologybymetagenomics.作者利用病*宏基因组学技术（Viralmetagenomics，VM），对16头患有非化脓性脑炎牛的脑组织进行二代测序，利用改进过的生物信息学流程进行病原体检测，检测出包括牛副流感病*（PIV-5），牛星状病*（BoAstV-CH13/NeuroS1），牛多瘤病*2型(BPyV-2SF)，绵羊疱疹病*2型(OvHV-2)，牛疱疹病*6型(BHV-6)等一系列已知病*并发现一种新型未知病*，并将其命名为BoRV-CH15。该研究不仅通过VM研究丰富了引发牛脑炎疾病的病*组构成，还进一步展示出高通量测序在解析病*混合感染引发复杂临床症状的检测中具有的重要价值。
基于高通量测序技术建立的VM，其通过对特定环境中的所有病*进行富集，随后对提取的病*核酸进行高通量测序，并通过生物信息学方法与已知病*序列进行相似性比对，从而了解环境样本中病*组构成。目前，新型牛星状病*(BoAstV)已为确定为引发牛患非化脓性脑炎的病原体。BoAstV-CH13与在美国发现的BoAstV-NeuroS1非常相似，已在瑞士约25%的病因不明的患非化脓性脑炎牛中检测到，但其它患病动物病因仍然未知。为确定除BoAstV-CH13与BoAstV-NeuroS1外与牛非化脓性脑炎相关的病*性病原体，作者进行了如下研究：
将16头患非化脓性脑炎且病因不明的牛的脑组织构建RNA和DNA测序文库，于IlluminaHiSeq平台进行二代测序。通过序列比对去除宿主基因组，通过从头组装获得获得重叠群后，利用NCBI的BLSATN和BLASTX在GenBank中进行相似度比较，从而完成病*序列的种属分类，通过系统进化分析和多序列比对进行鉴定。检测得到6种病*存在，并通过设计特异性引物进行PCR验证测序结果，检测结果如图1所示。为了评估候选病*与非化脓性脑炎的相关性以及二代测序技术检测病*的敏感性，针对BoAstVCH13/NeuroS1、BoPyV-2SF、PIV-5、BoRV-CH15、BHV-6和OvHV-6进行了回顾性研究与统计学分析，结果表明：BoAstV-CH13(P0.)、BoPV2-SF(P0.)和BoHV6(P4.3E-05)均与非化脓性脑炎密切相关，且存在多病*混合感染的情况（分析结果如图1所示)。
图1利用二代测序、PCR、RT-PCR和qPCR检测非化脓性脑炎牛和对照牛的病*存在。
为检测新型未知病*序列的存在，在从头组装生成重叠群后，通过对比牛的参考基因组进行分析从而筛选相关序列。结果表明：绝大多数从头组装的重叠群非来源于病*，而是代表反刍动物、其他真核生物或未分配的序列（图2所示）。
图2组装重叠群的系统发育分配
(A)Y轴显示由不同样品构建的重叠群的总长度。
(B)条形图表明每个样本的非冗余核苷酸数据库中最佳BLASTN匹配的来源。
样品组RNA和DNA的同源性分析表明,两个序列在bp的长度上完全相同。将两个样品的读长重新映射到样品组DNA重叠群导致全序列覆盖，DNA文库的平均读长深度约为8x，RNA文库的平均读长深度约为x。序列分析显示了4个部分重叠的开放阅读框，可能编码特异性抗原(GAG)、蛋白酶(PRO)、DNA聚合酶(POL)和包膜蛋白(ENV)（结果如图3A所示)。随后通过针对GAG、PRO、POL、ENV进行PCR检测以验证测序结果（结果如图3B所示)。通过构建系统进化树与已知逆转录病*科经典病*株进行亲缘性分析，再次证实测序发现新型未知病*的真实存在，并命名为BoRV-CH15，GenBank登录号：KU（结果如图3C所示)。
图3牛脑炎脑组织中新型牛逆转录病*(BoRV)CH15的鉴定。
(A)推测的BoRV-CH15基因组和编码组特异性抗原(GAG)、蛋白酶(PRO)、DNA聚合酶(POL)和包膜(ENV)蛋白的开放阅读框的示意图。
(B)PCR检测样品组的BoRV。
(C)用最大似然法对BoRV-CH15基因组序列和逆转录病*科的代表性病*基因组进行系统发育分析。
该研究通过VM研究成功发现一种逆转录病*属新型病*BoRV-CH15,但在对照组动物中存在一只感染BoRV-CH15。因此，该病*与牛神经系统疾病的具体联系仍有待进一步被确定。此外，通过病*宏基因组检测、分子生物学检测与统计学处理相互结合分析发现存在多种病*混合感染，扩大了我们对引起牛非化脓性脑炎的候选病*范围的了解，表明确定病*存在与疾病之间存在复杂联系，需要通过病*核酸和抗原的原位检测、病*分离以及后续病*感染实验进行进一步后续研究。
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